2002/8/15

送作堆又拆散

以前提過,想知道某個基因的功能,常用方法就是去觀察當這個基因失去作用時,會對生物體或細胞造成什麼樣的改變。講個遺傳學家使用的行話,就是讓基因 "loss-of-function"。要使基因失去功能,經典的標準方法就是把基因剔除(knockout),而在目前為止,能夠把有目標地把基因剔除的實驗生物體系並不多,就只有酵母菌S. cerevisiaeS. pombe,紅黴菌Neurospora,四膜蟲Tetrahymena thermophila,以及老鼠等(註)。既然一般生物體是二倍體(2N),染色體通常是成對的,具有兩套同樣的基因,所以做實驗時必須要把兩條同源染色體上的基因都剔除掉,細胞才是真正地完全loss of function。問題就來了--利用實驗操作,剔除一條染色體上某個基因的發生頻率就已經很低了,所以我們通常實驗拿到的都是異型合子(姑且以Aa表示這個基因型),如果還要同時剔除同源染色體上的另一個變成aa,機率就更低更低了。該怎麼做才可以把兩個都剔除呢?在酵母菌與紅黴菌有世代交替的現象,可以誘生雙倍體世代進行減數分裂產生孢子,每個孢子長出來的就變成單倍體(1N),根本不必同時剔除同源的兩個基因。但是對於纖毛蟲或是老鼠就不能這麼做了,所以就只有讓不同性別、已經剔除掉一個基因的兩個異型合子交配(Aa x Aa),子代中自然會有四分之一會是aa。

原則有了--讓不同性別的異型合子交配,然後去篩選基因已剔除的同型合子子代;要實際執行,首先就要會分實驗對象的性別。你我雖不是老鼠,但是對於同為哺乳類的一員,公老鼠母老鼠總還不至於會「看」不出來;Tetrhaymena 這種纖毛蟲有七個性別(或精確地用詞是七種交配型),外觀看起來一模一樣,要怎麼分呢?既然人分不出來,就讓纖毛蟲自己告訴我們吧。所以在此號稱科學昌明的二十一世紀,區分纖毛蟲不同性別的方法還是得採用古老的「送作堆」法,把我們懷疑是否是不同交配型的纖毛蟲挨餓個一天,然後混在一起,使孤男寡女共處一室。如果兩者是不同的性別,大自然神奇的魔力開始發功,幾個小時之後就可以看到對對佳偶難分難捨地接合在一起;如果已經相混好一陣子了,兩造還是各游各的,彼此興趣缺缺,他們八成就是同一個交配型。

要產生同一對染色體上的對偶基因都被剔除的同型合子其實還有一個關鍵問題,就是這個基因如果十分重要,細胞少了它就無法存活,我們把兩套都給剔除之後細胞就死掉了,所以會永遠拿不到這樣的個體。為了克服這個困難,我們可以利用纖毛蟲特有的怪異特性--一個細胞有兩種細胞核:掌管生殖的小核 (micronucleus),與負責營養與生長代謝的大核(macronucleus)。既然平日細胞的維生是大核的任務,我們就把小核的基因剔除弄成同型合子但保有大核的正常基因,所以細胞照樣可以活得好好的;再把兩種不同交配型的混合,下一代就通通會變成大核也是基因被剔除的同型合子,假定這時候所有子代都死了,我們就知道這個基因確實是維持生命現象不可或缺的重要角色。要製造這種大小核不一樣而小核是同型合子的纖毛蟲,必須借助於特殊的「星星」品系("Star" strain)。星星品系細胞的小核有缺陷,接合生殖時無法交換遺傳物質給對方,只會從接合的伴侶那邊拿一套DNA過來。被接合的細胞兩套DNA被拿走一套還沒得交換,為了維生,只好把僅有的一套自行複製擴增補回兩套,所以兩套基因就變成一樣的同型合子了。而吃軟飯的星星品系也因為拿到小核DNA了,變成正常的細胞,回復雄風氣概,結束第一回合的接合之後稍事休息會開始大戰第二回合,再度進行接合。利用這樣的特性,我們就得挑好時機,當與星星品系接合的纖毛蟲第一回合辦完事情之後分開了,趕緊把落單的挑出來,才能拿到大小核不一樣的個體,萬一太遲讓他們開始了第二波,就會產生四個子代而把剔除破壞的基因傳遞到子代的大核去,這就來不及了。

在纖毛蟲身上把基因剔除這套複雜的遺傳學操作把戲是我們實驗室發展出來的,做這樣的實驗是一整天的長期抗戰。先找到不同的交配型,一大早把小核基因剔除的異型合子細胞與星星品系送作堆,四個小時之後看到接合的對對佳偶後把一對對各自挑出來,放到培養皿的小液滴裡各自去開房間,以便觀察進度。十個小時之後第一回合開始進入尾聲,就要一個液滴一個液滴仔細瞧,看看哪對已經分開了,然後二話不說立刻用小毛細管分別吸出來隔離,拆散小倆口不得相會。有的纖毛蟲分開得早,有些接合則是莫名其妙地持久,等到十七八個小時還不分開,蟲蟲不覺得累,做實驗的人卻脖子酸眼睛澀,等得不耐煩了。還有些接合的纖毛蟲因為不知名的因素永遠都不會分開,就這樣不清不白地死在溫柔鄉中。

在這牛郎織女一年一度要相會的時刻,我在實驗室裡把這群纖毛蟲送作堆又拆散,破壞人家的感情,會不會有因果報應?老天明鑑,這是科學之必須,實驗之必須,論文之必須。我真的不是沒事存心要玩弄這些可憐的小生物啊。

註:其實果蠅的基因剔除技術已經發展出來,不過到目前為止僅是證實技術性可行,同儕間尚未廣泛應用。

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