2008/6/21

綠藻枝仔冰

進實驗室動手做研究的人,許多時候會感到很挫折,因為某些實驗往往想起來很簡單,文獻上寫的方法步驟也不複雜,但是實際上做下去卻不是那麼一回事。出問題的地方常是一些枝微末節的小事,雖然好像沒什麼大不了的,但遇上這樣的問題,有時候就擾亂了實驗步調,影響情緒,增加許多困擾。如果有幸解決了,當研究結果要發表時,卻因為投稿文章的篇幅有限,技術問題通常不會寫進原始文獻裡,況且這種「小事情」不是所要探討的課題重點,為突顯主題不宜旁生枝節。到最後要怎麼 解決這種技術難題,往往就變成某實驗室的祕技,不為外人所知。

最近實驗室來了一位訪問學者,其實她算是我們的資深學姊,二十多年前就在我們實驗室從事博士後研究,後來找到教職,當教授去了。我老闆不知道是怎麼遊說的,讓她願意回來短暫訪問幾週,動手做一些實驗,而老闆指派我跟著這位老學姊一起做。大家討論研究主題,決定拿單細胞鞭毛藻為材料,用生化方法來找出細胞 質內與纖毛鞭毛生長有關的活性蛋白分子,所以第一步是要能夠製備出高濃度的細胞質萃取液。

經過一番討論,我們的構想是這樣的:我們先養出一大缸一大缸綠藻,接著把細胞分批拿去離心,比較重的細胞會沉在離心管底部,與原本養細胞的液體分離。把上面的液體倒掉後,用少量的緩衝液重新把沉在底部的細胞打散,就能濃縮細胞的濃度。反覆幾次,把好幾缸的細胞集中起來,懸浮液體積愈來愈小,於是得到的是很濃很濃的細胞。然後把這些高濃度細胞用液態氮快速冷凍再重新解凍,經過這樣又凍又融化,細胞膜會破掉,把細胞質釋放出來,成為一小鍋細胞質濃湯。最後把這小鍋濃湯用超高速離心機再離心一次,把細胞璧、破碎的細胞碎片… 等等重物甩到管底,小心吸出上面的液體,這就是我們要的高濃度細胞質萃取液。

只要養好細胞、離心、除去液體、冷凍解凍、再去高速離心,這樣就行了。很簡單吧。當初我們也都這麼想。結果等到把濃度很高的細胞冷凍解凍後,想將細胞質濃湯放進超高速離心機所用的小離心管裡,問題卻來了。原來這時候細胞已經濃縮太多倍,說是細胞濃湯,其實是黏稠如膏狀,用微量吸管吸都吸不起來,通通沾附在 吸管頭上,無法移進高速離心管裡。老學姊想了想,放棄用吸管去吸取,改用小藥杓去刮,結果照樣黏得到處都是,狼狽不堪,材料損失大半。我說不如先不解凍,趁著還凍成固態的細胞冰塊時趕緊打碎,然後用小鑷子把細胞碎冰夾起來丟到高速離心管裡再讓它解凍。聽來可行,但試了一下,我們的動作太慢,小碎冰一下子就融化了,還是東沾西黏搞得髒兮兮。把養了好幾天的幾公升綠藻濃縮成幾cc,就剩下最後一個步驟,結果現在卻卡在這裡。怎麼辦呢?

老學姊突然靈光一閃,說:Let's try to make some Popsicle!

Popsicle? 這是什麼?原來 Popsicle 是美國小孩子常吃的冰棒。老學姊拉直了迴紋針,用鉗子剪成兩段小鐵條,在快速冷凍細胞時把小鐵條插到濃濃細胞湯膏中,等到冰凍成固體了,捏住小鐵條一拉,凍結的綠藻細胞膏就變成一根迷你的綠藻枝仔冰,可以放進小高速離心管裡,讓它解凍融化後直接去超高速離心。輕輕鬆鬆,乾乾淨淨,而且我們可以把好幾枝迷你小冰棒先後放到同一個小離心管中,就能將所有的樣品集中收集在同一個管子中,避免不同管之間的變異。

哈哈,老學姊得意得不得了。就靠她的這招綠藻枝仔冰,我們解決了如何移動濃稠細胞湯膏的技術瓶頸。


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2008/4/1

愚人節的故事


今天是愚人節。每年到了這一天,我就會想起這件往事。不過這樣的情況短期內或許不會再發生了,就用這篇舊文章來紀念一下吧。

每年的四月一日是愚人節。每週四是著名的科學期刊《自然》(Nature)出刊的日子。每隔十一年左右,就會碰上一個四月一日是星期四,就會有一期《自然》在愚人節出刊。今年 (註:這篇是2004年完成的舊文) 就是這樣,還有一九九三年、一九八二年也是。

一九九三年四月時我讀大三,有門必修課是動物發生學。發生學 (developmental biology) 現在一般都翻譯成發育生物學,是討論生物從受精卵如何變成個體,包括成長分化衰老死亡這些過程的學問。有一天上課講到了老化,老師說要補 充一篇最近剛出爐發表在《自然》上的綜論文章,報導有關長生不老研究的最新進展。根據這篇文章指出,科學家透過研究鯉魚,並且運用老鼠的分子遺傳學技術, 對於如何延遲老化死亡有了新的發現。有位在加州某校的研究者去探討為什麼鯉魚或烏龜等這些變溫動物似乎的壽命都比較長,結果他發現鯉魚腸道中有某種物質是 關鍵。這個物質有兩條短的蛋白質鏈組成,一條是鯉魚腸子中的細菌所製造釋出,另一條由某類魚腸內皮細胞所分泌。這種物質的化學性質極不穩定,遇熱就分解,所以極難研究。不過科學家經過十年的努力,已經選殖到這兩個基因,而且透過定位突變的方式成功地改良使它變成比較穩定,並且還把基因轉殖到老鼠體內。這些 老鼠就真的活得特別久,是正常壽命的好幾倍,不過出現了一些副作用,包括怕光、長出鱗片狀構造等等。報導中說研究人員還探討了把轉殖了這個長壽基因的老鼠 與跟細胞死亡基因突變的老鼠交配後子代的表型,證明這些基因彼此間有交互作用。

哇,竟然從鯉魚的研究找到了可以影響哺乳動物壽命的關鍵,這真是令人興奮的大發現!不過老師說他想找更多的相關研究與原始文獻來補充,但是文後所附的參考文獻台灣都找不到,所以很抱歉,他當前所能告訴我們的就只有這篇《自然》的報導所述的內容了。

其實這篇《自然》所附的文獻中有一篇是查得到的。這唯一查得到的一篇是《自然》在一九八二年的綜論文章,內容還是在說在鯉魚腸子中找到這個長壽物質。為什麼這麼大的發現,原始文獻卻都不在知名期刊上發表?或是都是尚在付印中呢?事情有一點奇怪了….

原來一九九三年與一九八二年這兩篇《自然》的文章都是在四月一日出刊的,是英國人的幽默玩笑啦!當年六月某期的讀者投書就刊出了各國各地科學家的回應,有稱讚玩笑開得很高明、正好拿去捉弄同僚與學生的美國人,有一板一眼批評不該在嚴謹科學刊物作弄人的德國人,有表示很無辜上當但是自我嘲笑一番的西班牙人,還有人很 kuso 順著玩笑繼續回應下去。《自然》的編輯也承認是玩笑了,並且說當期的另一篇書評也是愚人節笑話,可別當真喔。

哇哈哈,當大家愈相信不會騙人的人,其實騙起人來最高明。不過這個小小的(或大大的)玩笑卻讓我有一點點警覺:平常我們看期刊時,除了與自己專擅與本身研究相關的領域會去找出原始文獻來細讀,其他的新知大都就是這樣看看綜論評述或報導了。固然有意要開玩笑的例子是少之又少,但是其中若無心犯錯有問題,大概也渾然未覺吧。而當下有些中文的科學新知網站,主要是由熱心的研究生們去參考與翻譯各大期刊的綜論,就更要小心篩選了。去年 (註:2003) 英國知名的基因體研究機構也在愚人節時弄了個網頁,說是定序測出了霸王龍 (T. rex) 的基因體序列,就有位老兄誤以為真,寫了篇報導來介紹這個大發現

今年 (註:2004) 愚人節又遇上是《自然》出刊日,我小心地翻一翻,想看看這個長生不老的笑話有沒有又出來。結果是沒有。破解長生不老之謎既然是假的,過了二十年,笑話大概老死了。


這兩篇《自然》的愚人節玩笑在
Correspondent, A. (1982). The Elixir of Life. Nature 296: 392.
Weiss, R.A. (1993). Dorian Gray mice. Nature 362: 411.


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2008/3/17

纖毛大會


去年夏天,我們去佛蒙特州的山中小村莊開會,那是由美國實驗生物學會聯盟(FASEB)承辦的暑期研討會之一。這個暑期系列會議每場參加的人數不多,只有一百多人,是對某個專門的研究領域或課題有興趣的人員,大家就關在一個荒郊野外的寄宿學校,天天從早到晚聽演講看壁報。這與神經生物學年會或細胞生物學會等各大型學會年會,與會人數動輒成千上萬,必須在像世貿中心這樣的大展場才容納得下的學術大拜拜形式很不一樣。

這個研討會主題是「纖毛與鞭毛的生物學」("Biology of Cilia and Flagella"),號稱是八零年代以後首度把與這個領域相關的人士齊聚一堂,共同研討。纖毛的結構與運動機轉曾經是細胞學研究的重要題材,不過關於纖 毛的研究後來就漸漸冷了下來,也沒有定期的集會研討。現在之所以能夠募得經費補助,促成這個會議的原因,主要是近十年來的研究發現有許多遺傳疾病的成因,都是因為與纖毛有關的基因發生了突變。所以當前有個通行的假說,認為纖毛與鞭毛除了廣為人知的運動功能之外,還是負責感應外界訊息的細胞受器與訊號處理中心,與調控細胞的生長分化發育息息相關。

開了五天會,大家說 bye-bye,三年後再見。不過並不是船過水無痕。為了擴大影響力,有人自告奮勇,寫了一篇會議摘要報告。他從上台報告的研究者中挑選了一些他個人認為比較重要且有趣的發現,寫成綜論文章,試圖勾勒出纖毛生物學當前熱門的研究面貌與重點方向,並指引對未來的展望。這位先生最後與會議的發起人之一兩人聯名把摘要報告發 表在《細胞生物學期刊》(Journal of Cell Biology)上,文章的題目叫做 "Making Sense of Cilia"。用這樣一個花俏的題目,刻意要語帶雙關地把 sense(感覺)這個字眼放進來,就知道在這個作者與會議籌辦人心中當前最重要的纖毛相關研究,是要了解纖毛如何擔任細胞感覺胞器的角色。而整篇摘要報 告的內容也真的偏重在介紹纖毛的感覺功能,訊息傳遞與致病機制的研究,對纖毛鞭毛立體結構的研究輕描淡寫,而精子的鞭毛尾巴怎麼運動的研究則隻字未提。讀到這篇會議摘要的與會者,如果發現自己與相關同儕的成果竟然如此被冷落,心裡或許不是很好過吧。

會都開完半年多了,會議摘要報告也在好幾個月之前就已經登出來。況且當時會中報告尚未付梓的「新發現」,如今也大都已經正式發表刊出來,變成舊消息了。為什麼我要舊事重提呢?其實是最近查文獻時,偶然間發覺另外有位與會的義大利學者,會後也寫了篇摘要報告,投稿到一個不怎麼知名的小期刊。他也取了個故作俏皮的標題: "Stay tuned! It is an exciting era for the biology of cilia and flagella"。Tune 是調整頻率、對準頻道的意思,電視節目要進廣告之前常請電視機前的觀眾 "stay tuned",就是請觀眾頻道調好了,不要轉台別走開,精采的節目馬上回來。用這個片語當標題, 一方面表示纖毛生物學的研究正精采,別轉台跑掉,要繼續盯著欣賞;另一方面,也是再一次呼應著當前纖毛研究的熱門話題--它是細胞的天線,具有感應刺激,傳遞訊息的功能。

不過不同於先前的那篇,這位來自披薩國的老兄不得罪人,他的會議報告完完整整描述了每一位上台演講者的報告內容,重點不在評論研究現況,而是詳實紀錄會議過程,彷彿抄筆記一樣。沒去開會的人,看過後也可以知道到底哪些人報告了什麼事情。更特別的是這位義大利先生除了幫大家整理筆記,還擺了一張所有開會者的大合照,佔了將近半頁的篇幅。於是我看到自己小小的身影,混著其他一百多人中間,印在雜誌上面。雖然比不上阿簡老師既上電視新聞,大頭又登上月刊封面那麼風光,不過想一想,能在學術期刊上看到自己照片的機會畢竟不多啊,所以趕緊寫下來,炫耀一下。

以上浪費大家上網閱讀的時間,真不好意思。

這兩篇會議摘要報告的是:

Sloboda, R.D. and Rosenbaum, J.L. Making sense of cilia and flagella. J. Cell Biol. 179:575-82. 2007. 

Lupetti, P. Stay tuned! It is an exciting era for the biology of cilia and flagella. Tissue Cell 39:445-55. 2007.


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2008/3/15

纖纖細毛


我從博士班以來,所做的實驗都與纖毛(cilia)的形成有關係。纖毛雖然是包括人類在內的大多數生物細胞上普遍可見的胞器,但是畢竟是個聽起來不怎麼顯赫的東西。也因此不管是不是學生物的朋友,人們總問我:這個東西可以研究出什麼名堂?

老王賣瓜,我來自誇一下吧。不過廣告之外,從「纖毛生物學」研究受重視的冷熱變化,在某種程度上,我覺得也反映出美國生物醫學領域這些年來發展走向的某種模式。

其實纖毛是很有歷史淵源的構造。當年雷文霍克用顯微鏡觀察水中的單細胞生物時,最初描述紀錄到的微細構造之一,正是這些不斷地擺動,突出於細胞表面的微小胞器。纖毛的長度約0.005mm,有些長一點,有些短一點,依照不同的生物與細胞類型而定。現在人們把纖毛依運動方式分成兩種,大家所熟知的是會擺動的運動纖毛(motile cilia),這類也是雷文霍克在纖毛蟲身上所觀察到的纖毛,而人類呼吸道上皮細胞最表面的一層,正長滿了運動纖毛。這些纖毛擺動形成波浪推動黏液,而黏液沾附了所吸入空氣中的有害物質,變成痰而排出,所以這些纖毛可以幫助我們清除進入呼吸道的異物,跟人體健康有很大的關係。纖毛另有一個兄弟構造叫做鞭毛 (flagella),最知名的例子就是精子的尾巴。真核細胞的鞭毛與可運動纖毛的結構幾乎一模一樣,只是一般說來鞭毛比較長。鞭毛出問題不擺動了,精子游不動,就會造成雄性的不孕症。正因為這些因素,所以很早人們就對纖毛/鞭毛為什麼會擺動,到底是怎麼動的,結構是什麼,是哪些蛋白分子擔任這些角色,能量來源為何...等等問題很有興趣。而多年前我在課堂上修習細胞生物學時,這些就已經是教科書上的標準教材--學過細胞學的人,或許還記得教科書上曾提過纖毛/鞭毛的主體是軸絲 (axoneme),它的橫切面在電子顯微鏡下可見到微管 (microtubule) 構成"9+2"的美麗複雜結構;而運動蛋白 dynein 連結相鄰的微管,利用水解ATP的化學能改變運動蛋白的構型,造成微管的相對滑動,而使軸絲彎曲,讓纖毛擺動....。這些東西既然都已經寫在教科書上,表示在當時就已經是學界公認的基本知識,不是什麼有爭議未確認,正如火如荼探索中的新發現。換句話說,既然明確寫在課本中,就意味著重要的學說架構都已經被研究出來了,剩下的工作是去精練改進與補充這些模型。

科學研究就跟探險尋奇一樣,愈是新的未知的、愈能去開拓知識新疆界的研究,才會受到重視與讚揚,也才有辦法搶佔到廣為各領域的學者所閱讀的綜合知名學術期刊;如果只是對既有已知的舊範圍,做做重複查勘或是修正細節的事情,就得不到人家的重視。人們認為對於纖毛研究主要課題--結構與運動--大體上就是這麼一回事了,除非有實驗技術的突破,很難玩出新把戲。會趕熱潮搶流行的學界,就不會大量投注資源經費與注意力在這件事情上。纖毛生物學就變成一個特定專門的領域,為數不算多的實驗室研究某一細節,研究多只能發表在某些專門期刊。換句話坦白說,就是不熱門。

另一方面,人們用電子顯微鏡觀察細胞的超微細構造後,了解到另外還有一類不會擺動的纖毛 (non-motile cilia)。這類纖毛出現在神經細胞上,像許多感覺神經元的神經末梢,其實就是特化不動的纖毛,比方說:視網膜的視神經,鼻腔內的嗅神經,舌頭上的味蕾細胞,內耳的毛細胞等等。另外人們也發現:幾乎人體大多數的細胞在分裂完成,進入不再增殖的靜止時期,也會長出一根不會動的纖毛,稱為初級纖毛 (primary cilium)。只是或許「纖毛是會動的胞器」這種先入為主的觀念已深植人心,而且不會動的與會動的相比,分明就是缺少了某些構造功能,所以推想這些「非運動纖毛」或許沒什麼大用處,連由Albert與Watson等人所著的「聖經」級教科書 Molecular Biology of the Cell,在1994年第三版時就說初級纖毛「不具任何已知的功能」("has no known function")。

然而,這類「不具任何已知功能」的初級纖毛,卻正是讓冷僻的研究回溫的直接近因。遠因呢?則是起源於有兩條鞭毛的單胞藻衣藻 Chlamydomonas reinhardtti研究。

之前好一陣子纖毛鞭毛的細胞生物學研究沒怎麼能攫取人們的注意力,少數一些致力於此的實驗室大多利用一些特殊的材料來研究,像單胞藻正是這冷門中的主流模式生物:它容易大量培養,有助於生化分析純化;有各種鞭毛型態功能的突變種,可採行遺傳學技術。透過對單胞藻的研究,我們知道纖毛鞭毛的生長是像建高樓一樣,是從突出的遠端延長出去而不是從底部墊高;也找到一種像貨運電梯一樣的輸送作用,把構成纖毛的建材從底部的細胞本體送到頂端的組裝區;還發現負責輸送作用的蛋白分子,廣泛存在各種生物之中,具有演化的保留性。

但是這些還是無法引起大眾的注意。

直到人們發現一件奇怪的事情:在單胞藻中,有一個負責組裝鞭毛所必須的輸送作用的基因,當這個基因突變時,單胞藻無法長出鞭毛。線蟲 C. elegans 有相對應的基因,一如所料,突變時會影響感覺神經纖毛的型態與功能。而老鼠也有這個基因,不過讓人驚訝的是這個基因功能缺失的老鼠,卻帶有人類多囊腎臟病 (polycystic kidney disease) 的病徵。之前對多囊腎病的研究,已經知道是由兩種構成鈣離子孔道的膜蛋白基因缺失所造成,但是為什麼纖毛基因的缺失也有相同的病態呢?仔細觀察這隻多囊腎疾病老鼠的腎小管細胞,果然發現細胞上面那根不會動,「不具任何已知的功能」的初級纖毛都變短了,而後續研究發現先前找到的那兩個突變時會造成多囊腎病的膜蛋白,原來正是位在初級纖毛上面。所以大家開始推測﹔初級纖毛會不會是細胞的天線,上面有各種受體感應器,用以檢測外界的環境與刺激,進而影響細胞的反應?所以當纖毛壞掉了,這些受體感應器去不了正常該去的地方,功能因而被擾亂,腎小管細胞就無法對外界的訊息做出適當的反應,胡亂生長分裂,最後長出一個個空囊。就這樣,原來用老鼠,用斑馬魚,用線蟲等等實驗體系來研究其他腎臟病的人,甚至臨床研究的醫生,紛紛把目光投注在纖毛的形成機制上。

無獨有偶,當研究腎臟病的人注意到纖毛的重要,人們也發現另一種罕見遺傳性疾病跟纖毛的病變有關。這種病叫做 Bardet-Biedl 症候群 (Bardet-Biedl Syndrome,簡稱為 BBS),病狀很廣雜:異常肥胖,有六根手指腳趾;有的人視網膜退化,有的人身體左右相反,有的人兼得腎臟病,有的還有水腦症。突變造成 BBS 的基因在稍早就被鑑定出來了,陸續找到八個不同的基因(現在已經增加到十幾個),但面臨跟多囊腎病一樣的研究困境:搞不清楚為什麼這些基因的突變會造成 BBS,更何況導致如此龐雜的病徵。後來利用線蟲來探討這些 BBS 基因的研究者發現原來 BBS 基因產物位於纖毛的基部與纖毛內,還發現 BBS 基因產物功能與纖毛內的貨梯輸送作用有關。人們又恍然大悟,既然 BBS 基因功能與纖毛有關,而人體大多數的細胞都有初級纖毛,所以纖毛出了問題,影響到很多不同類型的細胞,就可以解釋為何 BBS 的症狀如此分歧雜亂,牽涉多種器官。最近有人進行蛋白質純化分析,更發覺細胞內多種 BBS 基因產物彼此結合在一起成為一大團複合體,可能負責在細胞內輸送分泌囊泡到纖毛基部去,以補充纖毛的細胞膜與上面的膜蛋白。現在,除了多囊腎臟病與 BBS 之外,陸續還發現多種遺傳疾病也都是纖毛的病變引起的。

人們知道纖毛跟疾病有關是一回事,為什麼會有關是另一個問題。而隨即有人適時補上這塊空白,發現纖毛參與了個體發育與細胞分化。研究胚胎發育的人發現他們利用誘導突變製造出來的數種神經管發育不正常的老鼠,竟然是由數個纖毛基因各自的病變所致。多個研究不同細胞表面受體與訊息傳遞的研究群,也發現他們各自研究的蛋白分子,是位在那不會動的初級纖毛上。細胞內的訊息傳遞是像工廠生產線一樣,一關一關,從一個分子傳到另一個分子。有的傳遞途徑的中間步驟必須在纖毛裡完成,否則傳到最終的輸出結果也就不一樣。於是人們提出假說,認為細胞上的初級纖毛不但像個天線偵測站,觀測外界的訊息;可能還是個資料處理中心,要整合不同的訊息,然後傳遞回細胞核的司令部去做決策。

發展至此,打算研究遺傳病的、研究個體發育的、研究細胞訊息的,或多或少都可以跟初級纖毛扯上關係,而且這個先前被說是「不具任何已知功能」的小傢伙,看起來功能還不少呢。纖毛鞭毛的相關研究不再只是學院裡面一些過了研究巔峰的老頭子,盯著奇怪罕見的微生物,研究了幾十年還捨不得放棄的冷題目,一個新的「纖毛病理學」("Ciliopathy") 領域就此開展,讓許多用不同的主流模式生物系統當材料做實驗、原本不關心纖毛的人跑來卡位,搶著開拓。

吹噓完畢。比起主宰一切的細胞核,或影響能量代謝與細胞凋亡的粒線體等胞器,纖毛雖然是個不怎麼稱頭的結構,但是這幾年來開始鹹魚翻身,上得了檯面,原因就是大家發現這個突出細胞表面的小構造,或許跟你我的生老病都很有關係。

最後,前面提及從纖毛生物學研究的冷熱當例子,可以看出美國生物醫學的發展走向。對此我個人的體認就是--必須跟人類健康與疾病有關,才會變主流研究。基礎生物學研究雖然是一切發現的根基,但是當前演變下,卻變成只有扯上了疾病,扯上了發育,扯上了人類的健康福祉,才會變成熱門焦點,才可能在大學校園內找得到教職,才可能拿到聯邦經費做研究,十足的功利與實用導向。這樣對嗎?利用單細胞生物研究纖毛組成的我,當然很想理直氣壯的說不對,畢竟趨勢如此下去,對自身這種玩基礎研究的很不利啊。但是坦白講,講究實效不對嗎?今天的科學研究已不是幾世紀前歐洲貴族教士等等有錢有閒的知識階級,閒暇時在自家閣樓或後院動動手,滿足好奇心與成就感的副業興趣罷了。在那種情況下,可以自己愛玩什麼就玩什麼。但當今的生物醫學科學研究,是大筆資金與人力物力投注的專門職業,博士班研究生與博士後研究員多如過江之鯽,做起實驗來花錢如流水,但大多仰賴政府的生醫科研預算補助,花的是納稅人的錢。要不要考慮科研的投資效益呢?眼光固然要放長遠,但是資源資金有限的情況下,多遠的長遠是可容許的界限呢?所以功利實用與醫藥取向的趨勢對嗎?不對嗎?好嗎?不好嗎?真不是個有簡單答案的問題。


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